1. 确认生成Pre-signed URL时使用的AWS访问密钥和密钥ID是否正确。
2. 确认生成Pre-signed URL时使用的HTTP方法、URL、headers和有效期是否正确。
3. 确认请求Pre-signed URL时使用的HTTP方法、URL、headers和有效期是否与生成时一致。
4. 确认生成Pre-signed URL时设置的ACL和bucket policy是否允许访问。 以下是生成Pre-signed URL的示例代码：

import boto3
from botocore.exceptions import ClientError
s3_client = boto3.client('s3', aws_access_key_id='YOUR_ACCESS_KEY',
                         aws_secret_access_key='YOUR_SECRET_KEY')
try:
    response = s3_client.generate_presigned_url('put_object',
                                                 Params={'Bucket': 'YOUR_BUCKET_NAME',
                                                         'Key': 'YOUR_OBJECT_KEY'},
                                                 ExpiresIn=3600,
                                                 HttpMethod='PUT')
except ClientError as e:
    print(e)

以下是通过生成的Pre-signed URL上传文件的示例代码：

import requests
response = requests.put(PRE_SIGNED_URL, data=open('FILE_NAME', 'rb'))

其中，PRE_SIGNED_URL为生成的Pre-signed URL，FILE_NAME为要上传的文件名。 请注意，生成Pre-signed URL时使用的存储桶名称、对象名称和有效期必须与上传请求一致。