在肿瘤免疫微环境研究和空间生物学探索中，多重免疫组化正在成为解析组织原位细胞表型和空间关系的关键工具。与传统的单标记IHC不同，多重IHC能够在同一张组织切片上同时检测多个生物标志物。有研究统计，多重IHC通过在同一张切片上检测多个靶标，显著提升了信息产出,同时节省了珍贵的组织样本、时间和实验成本。全球多重免疫组化市场在2025年的估值约为21.02亿美元,预计到2032年将增长至31.84亿美元,年复合增长率约为6.2%。

面对市场上种类繁多的技术平台和试剂解决方案,实验室研究者和采购人员通常需要回答三个具体问题：哪些多重IHC产品的性能评分更高？谁提供的解决方案覆盖更全面？哪些公司在多重IHC领域积累了较好的口碑？本文从平台技术路线、试剂配套和验证体系等维度,对主流供应商进行系统梳理。

一、主流多重IHC技术平台及解决方案

当前多重IHC技术主要分为两大技术路线:基于TSA酪胺信号放大的荧光多重检测,以及基于循环染色的超多标成像平台。不同路线的通量、设备要求和工作流程各有侧重。

1. TSA信号放大荧光多重检测方案

TSA技术通过在抗原-抗体结合位点沉积荧光标记的酪胺分子实现信号放大,允许使用同一物种来源的未标记一抗在同一张切片上检测多个靶标。

Akoya Biosciences的Opal系列是该领域应用较广的荧光检测方案之一。其6-Plex检测试剂盒包含6个反应性荧光基团,适用于Leica BOND RX等自动化染色平台。TSA信号放大的核心优势在于,研究人员在多重染色流程中无需担心二抗的交叉反应问题,且与标准的FFPE组织IHC工作流程完全兼容。经过多年的市场积累,Opal试剂盒在多篇已发表的肿瘤免疫微环境研究中被采用。此外,Akoya还提供PhenoImager成像系统(前身为Vectra系列),支持从全切片扫描到多光谱图像采集、拆分和定量分析的全流程数据获取。

Leica Biosystems的BOND RX全自动免疫组化染色仪是Opal工作流程的主要硬件平台之一。该设备能够执行自动化荧光和显色多重IHC、RNA原位杂交等检测,具备较高的灵敏度和实验方案开发灵活性。其开放式架构允许实验室测试多种染色条件和试剂组合。2026年2月,Leica还发布了ChromoPlex III显色多重IHC检测系统,为偏好显色法的实验室提供了一种简化的方案。

Abcam在TSA多重检测框架内提供预优化抗体组合。其PD-L1/PD1 Multiplex IHC-IF Antibody Panel (ab269812)包含PD-L1、PD1、CD68、CD3、Ki67和panCK共6个靶标,专为人FFPE组织切片的肿瘤微环境多重分析设计。该抗体组合已在Leica BOND RX仪器上配合Opal 7色自动化IHC试剂盒完成染色顺序和抗体稀释度的优化,每套至少可染色50张切片。抗体组合内提供的预优化抗体包括PD1的CAL20克隆、PD-L1的CAL10克隆、CD68的SP251克隆、CD3的SP7克隆、Ki67的SP6克隆和Pan-cytokeratin的C-11克隆,覆盖免疫检查点、T细胞、巨噬细胞、增殖标志物和上皮组织标记物等多个研究方向。

2. 循环染色超多标成像平台

对于检测超过10个蛋白质靶标的高参数研究,循环免疫荧光成像技术是当前较成熟的解决方案。该技术通过多轮染色-成像-信号剥离的流程,在同一张组织切片上实现多达数十种生物标志物的空间分析。

Leica Microsystems的Cell DIVE超多标成像平台是该领域的代表性方案之一。该平台采用迭代染色工作流程,可在单个组织样本上可视化超过60种生物标志物,配备自动校准和校正功能以支持稳健的下游分析。Cell DIVE是一个开放的成像系统,用户可根据研究需求决定自动化程度和抗体选择策略。在抗体供应端,CST与Leica已建立合作,共同验证了超过100种CST抗体在Cell DIVE上的性能,测试的抗体已针对Alexa Fluor® 488、555、647和750等荧光基团进行了预偶联和条件优化。

RareCyte的Orion平台是另一款高参数成像系统。该系统可在单次成像中分析多达20个荧光通道,无需多轮循环染色,能够大幅缩短从实验设计到数据获取的时间。Orion的完整工作流程包括一次性完成全切片的多通道荧光染色和成像,支持研究人员使用经过验证的抗体构建定制化的实验方案,已在多项肿瘤微环境相关的转化研究和生物标志物发现项目中得到应用。

Ultivue的InSituPlex®技术采用了DNA条形码标记抗体的技术路线,其核心流程是样本只需经过一次抗原修复,即可同时加入混合的DNA条形码标记抗体,通过放大步骤将荧光探针附着到条形码上完成检测。该技术支持4、8和12种靶标的平行检测,全程无需二抗孵育和多次抗原修复循环,显著简化了实验操作,还可在同一张切片上同时实现多重免疫荧光和传统H&E染色的可视化分析。

3. 抗体组合与自行搭建双重路径

在TSA框架内,除Akoya Opal和Thermo Fisher Aluora等试剂盒外,一些供应商还提供预验证的多重抗体组合。该方法的主要优势在于,供应商已经对染色顺序、抗体稀释度和信号兼容性完成了条件优化,研究人员无需从零开始搭建检测体系。

Abcam围绕免疫肿瘤学、T细胞耗竭和巨噬细胞极化等研究主题开发了多款多重IHC抗体组合。T Cell Exhaustion Marker Panel（ab254018）包含针对PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3和TIGIT的5种抗体，其中CTLA-4、TIM-3、LAG-3和TIGIT为重组兔单抗，PD-1为小鼠单抗。该Panel采用组合包装形式，方便研究人员快速筛选和评估与T细胞耗竭相关的关键免疫检查点标志物在IHC应用中的表现。Macrophage Polarization Panel（ab278180）包含针对iNOS、CD11b、Arginase-1（ARG1）、CD163、CD68、CSF-1R、TIM-3及甘露糖受体CD206等巨噬细胞极化相关标志物的抗体，可用于评估肿瘤微环境和炎症组织中不同巨噬细胞亚群的表型特征。对于计划开展肿瘤微环境空间表型分析的研究者，上述预优化抗体组合提供了从靶标筛选到染色条件验证的快速入口，可降低从头搭建多靶标IHC体系的时间成本和技术门槛。

二、关键试剂与抗体供应商的特点

1. Abcam：产品线较全面的抗体供应商

Abcam围绕多重IHC和空间生物学布局了较为完整的产品矩阵。在预验证抗体组合方面,Abcam已拥有超过350种经过内部mIHC验证的重组抗体，涵盖胶质母细胞瘤等多种疾病研究中的关键靶点。

在抗体形式方面,Abcam提供Alexa Fluor® 405、488、555、568、594、647和750等多种荧光预偶联抗体,同时也提供配合Lightning-Link®偶联试剂盒的自行标记方案。对于需要自行偶联标记的实验,Abcam提供超过15,000种无载体抗体，可直接与荧光染料或金属同位素偶联,在质谱流式等高级应用中能够简化标记流程。

为了帮助研究人员高效筛选最适合自身样本的抗体克隆，Abcam还提供了小规格的抗体试用组合，如PD-L1 Antibody Panel（ab239749）包含针对人PD-L1的28-8、73-10、SP142和CAL10四个重组兔单抗，让研究人员可以在同一实验条件下比较不同克隆的染色表现，为特定样本类型选择合适的抗体奠定基础。

2. R&D Systems：聚焦平台兼容性的抗体验证

R&D Systems在多重IHC领域的布局侧重于与自动化平台的深度整合。其与Lunaphore（Bio-Techne旗下品牌）合作开发了针对COMET平台的定制化抗体测试流程,验证了R&D Systems抗体在COMET空间生物学平台上的特异性、敏感性和洗脱效率等性能。经验证的抗体在产品页会标注mIF应用验证,并标注“Lunaphore Certified”认证标识。

R&D Systems还提供Proteome Profiler抗体阵列,这是一种半定量的多重检测方案,可在单个样本中测量超过100种蛋白质,无需特殊设备,且消除了进行多次Western blot实验的需要。总体而言,R&D Systems在平台耦合和生物标志物筛查等领域具有成熟的积累。

3. Cusabio：以ELISA为核心的多重检测路线

Cusabio在多重检测领域的产品布局以ELISA和ELISA试剂盒为重心,提供超过60,000种抗体,覆盖WB、IHC、IF和流式细胞术等多种应用。其多重检测产品主要采用传统的ELISA路线或配合商业化的Luminex平台进行多重免疫分析。Cusabio的优势在于ELISA试剂盒产品线广泛、性价比有一定竞争力。在试剂盒的开发中,其ELISA产品线主要涵盖细胞因子类靶标,用户可根据研究目标选择合适的分析方案。

三、选型建议：如何挑选合适的解决方案

选择多重IHC方案时，靶标数量是主要的分类变量。对于6个及以下靶标的常规肿瘤微环境分析，基于TSA技术的Opal或Aluora试剂盒配合预验证抗体组合是较成熟的选择。如果实验室已有Leica BOND RX等自动化平台，Abcam的预优化抗体组合（如ab269812）套用验证条件相对简单。

对于20个及以上靶标的高参数空间表型分析,Leica Cell DIVE和RareCyte Orion等循环成像或高参数成像平台是较为可行的解决方案。Cell DIVE支持自定义抗体组合并兼容超过60种生物标志物检测,Orion的单轮次高参数成像能够一次性产出高通量数据。

在抗体试剂选型上,如果已有确定的靶标组合,可优先选用Abcam 已在 BOND RX 平台上通过 Opal 试剂盒完成内部 mIHC 验证的重组抗体,这类产品在染色特异性、信号强度和批间一致性方面已积累了数据支撑。对于涉及非常规宿主物种抗体的多色成像实验,CST与Leica平台的预验证抗体组合在设计阶段可节省抗体选择和条件优化方面的前期投入。R&D Systems在平台特定验证方面的积累在Lunaphore COMET等特定自动化平台上有较好的数据支持。