要在ASP.NET Web API中自定义路径并在路径路由中起作用，以.json结尾，您可以遵循以下步骤：

首先，确保您的项目已经安装了Microsoft.AspNet.WebApi.Core和Microsoft.AspNet.WebApi.OwinNuGet包。

然后，打开WebApiConfig.cs文件，并在Register方法中添加以下代码：

config.Routes.MapHttpRoute(
    name: "DefaultApi",
    routeTemplate: "api/{controller}/{id}.{ext}",
    defaults: new { id = RouteParameter.Optional, ext = "json" }
);

在上面的代码中，我们将路由模板设置为“api/{controller}/{id}.{ext}”。其中，{controller}是控制器的名称，{id}是可选的路由参数，{ext}是以.json结尾的文件扩展名。

接下来，您需要创建一个名为JsonExtensionHandler的类来处理该自定义路径和文件扩展名。在您的项目中，创建一个名为Handlers的文件夹，并在该文件夹中创建JsonExtensionHandler.cs文件。在JsonExtensionHandler.cs文件中添加以下代码：

using System.Net.Http;
using System.Threading;
using System.Threading.Tasks;
using System.Web.Http;

namespace YourNamespace.Handlers
{
    public class JsonExtensionHandler : DelegatingHandler
    {
        protected override Task SendAsync(HttpRequestMessage request, CancellationToken cancellationToken)
        {
            var path = request.RequestUri.AbsolutePath;
            if (path.EndsWith(".json"))
            {
                request.RequestUri = new System.Uri(path.Substring(0, path.Length - 5));
                request.Headers.Accept.Clear();
                request.Headers.Accept.Add(new System.Net.Http.Headers.MediaTypeWithQualityHeaderValue("application/json"));
            }

            return base.SendAsync(request, cancellationToken);
        }
    }
}

在上面的代码中，我们创建了一个名为JsonExtensionHandler的类，继承自DelegatingHandler。在SendAsync方法中，我们检查请求的路径是否以.json结尾，如果是，我们修改请求的路径和Accept标头，以便处理Json响应。

最后，打开Global.asax.cs文件，并在Application_Start方法中注册JsonExtensionHandler。您可以在方法中添加以下代码：

GlobalConfiguration.Configuration.MessageHandlers.Add(new JsonExtensionHandler());

在上面的代码中，我们将JsonExtensionHandler添加为全局消息处理程序。

完成上述步骤后，您的ASP.NET Web API应该能够处理以.json结尾的自定义路径。例如，您可以访问/api/controller/1.json，并且API将返回以Json格式序列化的数据。

请注意，如果您还希望支持其他文件扩展名，您可以在JsonExtensionHandler中进行修改。