浙江大学姜治伟、杨国利等人在期刊“Advances in Colloid and Interface Science”发表了一篇题为“Genetically modified organoids for tissue engineering and regenerative medicine”的文章。该文章综述了近年来类器官基因编辑的研究，介绍了基因编辑类器官的转染方法和功能，并详细介绍了其应用。此外，还讨论了类器官基因编辑的局限性和未来发展方向。

文章介绍

• 题目：Genetically modified organoids for tissue engineering and regenerative medicine（用于组织工程和再生医学的基因编辑类器官）
• 杂志：Advances in Colloid and Interface Science
• 影响因子：15.9
• 发表日期：2024年11月

类器官技术已成为生物医学应用领域的热点，在组织工程和再生医学方面显示出巨大的潜力，且类器官与基因编辑技术相结合增强了类器官在组织工程中的作用。

基因编辑类器官是基于基因转染和类器官培养技术，已通过多种机制用于癌症研究和治疗、体外疾病诊断模型的建立、临床前药物筛选、基因校正、器官发育、组织修复和再生。尽管各种转基因类器官的研究正在取得进展，但它们仍处于实验阶段，临床经验仍然缺乏。

图文摘要

本综述阐述了制备转基因类器官的不同方法和特性，并总结了各类基因编辑类器官的信息，及其在不同领域的应用进展。最后讨论了面向美好未来的基因编辑类器官发展的挑战和方向。

表1 具有代表性的基因编辑类器官制造及应用

一、基因编辑类器官的制备

基因编辑类器官的制备包括类器官构建和基因转染。目前构建基因编辑类器官的方法主要有基因转染-类器官构建和类器官构建-基因转染两种。将基因转染到靶细胞中，然后利用转基因细胞构建类器官相对来说更流行，转染效率更高。

图1 制备转基因类器官的示意图

1、类器官的制备

类器官是一种3D体外培养模型，来源于自组织干细胞，模仿体内器官的结构和功能特异性。形态学重排通过细胞分选和结构重排发生，涉及细胞-细胞粘附、细胞运动性、皮质张力和/或收缩性的差异，以及系统内在力学的变化。此外，培养环境中的细胞外基质（ECM）成分和生长因子、培养方法、对系统自主和/或外源信号的要求、起始细胞类型和系统条件是影响最终类器官的特性有关键因素。

表2 再生医学中代表性类器官基因编辑方法的优缺点

2、通过病毒转染制备基因编辑类器官

利用病毒载体进行基因修饰可以实现较高的转染效率和基因的长期表达。病毒载体是将基因传递到靶细胞的有效工具，主要包括慢病毒（LV）、腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒（RV）和单纯疱疹病毒（HSV）。用于产生基因编辑类器官的主要病毒载体是LV。

尽管病毒具有转移遗传物质的能力，但仍存在许多问题，如安全性不可控、制造困难、靶向质粒的能力和大小有限等。因此，未来的研究方向是开发低遗传毒性和免疫原性与高效传递相结合的病毒载体，探索更成熟可靠的病毒转染方法，优化基因编辑类器官的制备工艺。

图2 类器官传递遗传物质的机制

（1）LV诱导的转基因类器官

LV是RV家族的成员，既能转导非分裂细胞，也能转导分裂细胞，具有免疫原性低、转基因表达稳定而不导致细胞裂解的优点。此外，LV可以整合到宿主基因组中，在基因转录活跃的区域进行细胞分裂后稳定表达转染的基因。

在感染前将类器官分离成单细胞悬浮液可以显著提高感染效率。在感染细胞重新聚集后，生成的类器官的基因编辑效率提高。此外，人类细胞中的基因沉默是LV用于复杂再生医学工程和治疗的主要障碍。使用LV将遗传物质半随机整合到细胞中往往会导致随着时间的推移表达减少，甚至完全丢失，在多能干细胞（PSC）中尤为明显。选择适当的启动子，支架附着区、复制起始点或CpG岛的使用是应对基因沉默的潜在策略。

一些研究已经应用LV或其载体来产生基因编辑肠道疾病类器官。短发夹RNA（shRNA）是通过LV产生的载体感染哺乳动物细胞而传递到细胞中的。例如，在LV质粒载体上构建shRNA克隆进行SLFN11敲低实验，并将LV转染慢性炎症结肠类器官，模拟溃疡性结肠炎基因编辑的体外模型。成功转染LV后，SLFN11敲低可有效抑制炎症诱导的肠上皮细胞凋亡。许多因素可能影响RNA干扰在LV的产生和转导中的效率。

图3 转染方法示意图

（2）RABV诱导的转基因类器官

狂犬病毒（RABV）是一种负链RNA病毒，可以作为突触连接神经元群体的逆行示踪剂。目前，基于RABV的技术允许在神经环路测绘研究中逆行追踪，以及对初级感觉神经元和跨突触神经元的顺行追踪。RABV严格地跨突触运输，很少扩散到非神经元细胞。RABV系统用于单突触逆行追踪也已用于类器官。研究人员利用HSV修饰转导来表达RABV的示踪机制。注射HSV一周后，类器官移植物中出现大量GFP+细胞。通过GFP的病毒转导追踪表明，视网膜输出通过突触连接到达类器官移植物。

3、非病毒转染制备基因编辑类器官

非病毒转染技术具有经济高效、简单灵活、安全性高、通量大等优点，主要有物理途径和化学途径。

（1）基于物理和化学方法的基因编辑类器官

物理方法是通过在质膜上形成的瞬时孔将核酸转运到细胞质中，而化学方法是通过用化学材料包装DNA来传递基因。用于基因编辑类器官的主要物理方法是电穿孔。化学方法是利用DNA带负电的特性，采用带正电的聚合物结合DNA形成非病毒载体。

电穿孔是一种在细胞膜上产生瞬态电孔的电转化方法，其效率高、适用性广。与单独注射DNA相比，电穿孔导致基因表达增加20-1000倍。用于基因电转的脉冲电参数会影响DNA跨质膜易位的起始步骤，对转染效率至关重要。过高电压的电脉冲会导致不可逆电穿孔导致细胞死亡。电穿孔可能是一种很有前途的非病毒基因传递方法。然而，它的许多缺点，如电穿孔转染效率不同，电穿孔细胞生存能力仍然较低，有待研究人员进一步优化。

最广泛采用的化学方法是脂质体转染。Lipofectamine用于细胞转染，Lipoplex，一种脂质和DNA的复合物，用于传递转染的基因。Lipofectamine 2000（Lipo2000）是一种多功能转染试剂，在转染广泛的贴壁和单细胞系方面是有效的。它具有适用性广、转染效率高、可重复性好等优点。Lipo2000递送系统也已被广泛用于小干扰RNA（siRNA）转染，构建用于基因编辑的质粒，能够导致肠道类器官中进行遗传修饰导致目标基因表达水平持续增加8倍，显示出优越的抗炎和修复能力。

（2）基于CRISPR-Cas9的基因编辑类器官

CRISPR系统在系统发育多样的古细菌和细菌基因组中得到认可。CRISPR位点可防止被编码小非信使RNA的短重复序列分离的原始病毒株感染。与CRISPR区域相邻的四个基因是CRISPR相关（Cas）基因。Cas9在Cas核酸家族中显示出独特的潜力。CRISPR-Cas9免疫应答包括适应、表达和干扰。一个Cas蛋白复合物遇到一个短的原间隔邻近基序（PAM），它与入侵的DNA分子结合，并导致其两条双链断裂，将两个重复序列之间的短DNA片段整合在一起。Cas基因表达和CRISPR转录成crRNA，引导Cas9到达目标位置。在单导RNA（sgRNA）的指导下，理论上可以将供体模板引入靶细胞，精确修饰基因组序列。

CRISPR-Cas9系统首次应用于基因修饰类器官是2016年报道的诱导多能干细胞（iPSC）基因校正和定向分化，并建立了先天性角化不良肠类器官体外模型。在类器官中进行全基因组CRISPR-Cas9筛选的方法最初于2019年提出。在最近的一项研究中，利用CRISPR-Cas9系统从iPSC中删除HNF1B，构建肾脏疾病模型。类器官明场成像显示，CRISPR-Cas9基因编辑的类器官生长速度与对照组几乎相似，但具有分化差异和功能差异。CRISPR-Cas9也能用于转基因iPSC的基因校正，而且基因编辑后，iPSC多能性和自我更新试验没有差异。

（3）基于转基因动物的基因编辑类器官

人类发育和生物学的许多特征与快速繁殖和易于维护的啮齿动物高度相似。此外，小鼠在胚胎发育、器官发生、造血和免疫反应方面与人类惊人地相似。第一只KO小鼠于1989年诞生。转基因小鼠作为基因传递载体在基因编辑类器官领域得到了广泛的发展和改造。

近年来，开发了许多新的KO技术，包括Cre/loxP系统、CRISPR-Cas9系统、ZFN技术、TALEN技术等。小鼠的其他遗传修饰，包括缺失、插入、倒置、易位和点突变，已被设计用于研究基因结构与其功能之间的关系。Cre/loxP系统是将Cre重组酶置于组织特异性或阶段特异性启动子的控制下，并将Cre识别的loxP位点置于目标基因的两侧，可以删除感兴趣基因。ZFN技术与TALEN有相似之处。由可编程和序列特异性DNA结合模块组成，连接到非特异性DNA切割域。通过诱导DNA双链断裂和刺激特定基因组位点容易出错的NHEJ或HDR，可以实现广泛的遗传修饰。

二、基因编辑类器官的应用

类器官复制了体内器官的许多结构、组织和功能，有效地补充了现有的动物和二维细胞培养模型。基因编辑技术变得越来越高效，技术也更简单。基因编辑技术已广泛应用于类器官，通过表达基因的转基因技术来控制不同细胞的行为（图4）。这两种新技术的结合为许多有缺陷组织或遗传疾病的患者带来了新的治疗方法，在跟踪、修复、再生、药物筛选和疾病建模方面显示出独特的潜力（图5）。

图4 基因编辑类器官的应用

图5 用于再生医学临床前治疗的基因编辑类器官

1、基因编辑外胚层类器官

（1）脑类器官

大脑中大量不同类型的细胞，聚集在一起形成功能回路，参与复杂的相互作用。大脑皮层的发育始于神经上皮细胞。在皮质发育过程中，神经干细胞（NSC）和神经祖细胞（NPC）的谱系发展受到高度调控，产生多种细胞类型。CROCCP2是一种仅在人类胎儿大脑中高度表达的原始人特异性基因，在人类皮质细胞和类器官中，导致纤毛发生减少，皮质祖细胞，尤其是基底祖细胞扩张增加。这种人类特有的皮层神经发生调节剂将纤毛动力学、mTOR和基底祖细胞的增加联系起来，表明最近的基因复制是人类大脑体积和复杂性增加的重要分子效应。

在最近的一项研究中，LRRK2-G2019S突变中脑类器官被用来验证基于LRRK2的晚发型帕金森病发病机制的基本假设，在病理研究和药物筛选中具有重要意义。转基因脑类器官也被用于基础实验的追踪。在神经分化过程中，通过检测EGFP、TagRFP等荧光病毒的表达，直接观察人多能干细胞在神经分化过程中的过渡状态。报告细胞用于监测药物效应以增强神经诱导，监测基因敲低反应。它们随后被移植到小鼠胚胎大脑中，并以单细胞分辨率实时成像。证明它们在神经再生策略和人类皮层发育研究中的潜力。

（2）皮肤类器官

较大的皮肤缺损会不可逆转地破坏汗腺（SwG），且几乎所有患者成功治疗大面积皮肤缺损都是通过增生性瘢痕修复而非SwG再生。此外，许多遗传疾病与SwG的异常发育和功能有关。因此，皮肤SwG的再生已成为现代医学研究的重点。

转基因类器官是治疗这些疾病的有效方法之一。供体组织的缺乏和原代SwG细胞体外扩增能力低阻碍了SwG来源的细胞移植用于临床治疗。将EDA转染到人表皮角质形成细胞（HEK）中，生成重编程的SwG细胞，并证明了其具有人SwG细胞的功能特征。将SwG细胞包埋在基质中，并在诱导培养基中培养。2~3周后，类器官逐渐发育成含管腔形态，管腔被单层或多层上皮细胞包围。免疫荧光分析证实，这些自组装的类器官具有SwG特征，并能够进一步发展成功能性SwG。将该类器官移植到烫伤小鼠脚垫，证实了其具有汗腺再生和皮肤修复的功能。因此，基因编辑类器官在治疗皮肤缺陷方面显示出巨大的潜力。预计未来在治疗大面积烧伤的应用范围将扩大。

（3）视网膜类器官

视网膜疾病，如色素性视网膜炎（RP）和莱伯先天性黑蒙（LCA），导致许多人的生活质量下降。PRPF和RPGR基因的突变是RP显性形式的常见原因。基因编辑技术被认为是RP的有效治疗方法，转基因类器官已经在许多体外模型中显示出成功的结果。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术修复iPSC基因突变，生成视网膜类器官，发现基因矫正恢复了患者视网膜中有缺陷的感光器发育，为潜在的基因治疗铺平了道路。CRX是脊椎动物视网膜中负责感光神经元分化和维持的关键转录因子，其等位基因突变可导致多种不同的致盲视网膜病变，包括LCA，目前尚无有效的治疗方法。基因校正后，诱导hiPSC形成CRX+/−视网膜类器官，在一定程度上挽救了视网膜类器官中光感受器细胞的发育和成熟。因此等位基因特异性编辑方法可能是LCA的潜在治疗方法。

（4）泪腺类器官

PAX6是泪腺发育的重要转录因子，也是hPSC向泪腺细胞分化所必需的。通过使用PAX6-KO泪腺类器官，研究人员发现Pax6对小鼠类器官的分化能力至关重要，而不影响它们在体外的增殖潜力。PAX6-KO泪腺类器官降低了神经递质受体、与分泌机制有关的基因、泪液产物和参与视黄醇代谢的基因的表达。因此，基因编辑泪腺类器官可能为理解干眼病和干燥综合征的异常泪液产生提供有价值的见解，为更好地理解泪腺生物学和研究泪腺病理提供模型。

2、基因编辑中胚层类器官

（1）肾类器官

终末期肾脏疾病中，透析或肾移植的有效性和可获得性有限，因此再生医学的最终目标是产生新的肾组织用于移植。肾脏类器官已成为研究肾脏发育、生理和疾病的先进体外模型。使用不同的专门培养基、反应器和培养环境，可以从iPSC产生肾类器官。利用基因编辑技术破坏了与iPSC中肾脏和尿路先天性异常相关的HNF1B基因，导致不能形成近端小管，证实了肾类器官作为研究肾脏基因功能的基本人体系统的有效性。

然而，仍然缺乏一个强大的肾类器官模型来产生和扩大输尿管芽祖细胞（UPC），并概括成人收集管的成熟和空间模式。在最近的一项研究中，研究人员建立了一种新的类器官模型。RET是输尿管芽培养过程中的一个关键信号，其活性的丧失会导致CAKUT综合征。使用CRISPR/Cas9系统在类器官中进行RET KO，类器官分支形态发生停止，但下游基因表达不一致，符合小鼠和人肾发生的趋同和分化机制。基因编辑类器官为进一步研究人类CAKUT患者中发现的人类RET突变如何导致先天性肾脏畸形提供了一个独特的平台。

法布里病（FD）是一种X连锁溶酶体贮积性疾病，其特征是α-半乳糖苷酶A活性不足导致溶酶体神经酰胺三己糖苷积累。肾类器官实现了细胞内神经酰胺三己糖苷沉积的增加，从而再现了FD肾病表型。通过CRISPR/Cas-9靶向破坏A4GALT，FD肾病进展相关基因的表达水平下降。基因编辑类器官介导的A4GALT抑制有可能成为治疗FD肾病的新策略（图6）。通常使用CRISPR/Cas9技术敲除肾类器官中的一些基因来构建遗传缺陷疾病类器官模型。如利用CRISPR/Cas9在hPSC中引入双等位基因，截断PKD1或PKD2突变，建立PKD疾病模型。在另一项研究中，研究人员将类器官建模与器官芯片技术相结合。通过CRISPR/Cas9诱导PKHD1突变生成PKHD1敲除类器官。类器官芯片平台提供了适当的动态细胞微环境来模拟常染色体隐性PKD表型，揭示疾病的潜在治疗靶点。

然而，肾类器官系统的主要挑战是缺乏足够的血管生成。在微流控芯片上体外培养肾类器官，已成为研究的前沿。这种方法扩大了内源性内皮祖细胞池，形成了血管网络。该技术有望在血管化和更成熟的肾类器官制造中发挥重要作用。

图6 转基因肾类器官模型挽救FD肾病表型

3、转基因内胚层类器官

（1）肺类器官

SOX9突变可引起发育不良。在肺发育过程中，SOX9是远端肺祖细胞和软骨形成的标志物。SOX9在肺发育中的作用的相互矛盾可能是由于研究中使用的小鼠的遗传背景不同。说明动物模型在研究肺发育过程中的局限性。一项利用基因编辑技术从基因修饰的肺类器官中生成SOX9敲除hESC的研究证实了SOX9在人类肺发育中的作用，SOX9具有调节肺上皮细胞增殖的能力，但它并不是调节人肺上皮细胞发育的必需转录因子。Club细胞和肺泡2型（AT2）细胞是主要的肺上皮祖细胞，在体内负责维持体内平衡和修复损伤。基因编辑类器官培养证实，LKB1的缺失显著限制了Club细胞和AT2细胞的增殖。损伤气道上皮的恢复速度减慢，AT2表面活性剂蛋白C的分泌受损。LKB1敲除可能通过影响细胞自噬来抑制Club细胞体外增殖。因此，Claudin-18可能通过影响细胞粘附/完整性参与LKB1敲除诱导的AT2细胞增殖的减少。在动物模型中，转基因肺类器官具有治疗作用。这种方法仍在研究中，没有用于临床试验。

（2）肝类器官

非酒精性脂肪性肝炎分为非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。后者以脂肪变性为特征，可导致肝硬化和相关并发症，包括肝癌，以及心血管疾病的风险增加。构建一个人类脂肪性肝炎类器官以研究代谢状态对基因型-表型关联的影响。胰岛素不敏感条件下的大规模人群表型分析预测了关键的NASH遗传因素，包括葡萄糖激酶调节蛋白（GCKR）。结果显示，GCKR变异对伴有或不伴有糖尿病的NASH严重程度有相反的影响。转录组学、代谢组学和药理学分析的数据表明，GCKR变异与线粒体失调密切相关。脂肪酸加剧了线粒体持续活性氧的增加和氧气消耗率的降低，用氧化解偶联剂治疗可以使线粒体功能正常化，并抑制脂肪酸诱导的炎症反应。因此，GCKR修饰的NASH类器官可以整合临床分析。转基因NASH类器官使早期识别和实施预防和治疗策略成为可能。

（3）胰腺类器官

目前胰腺导管腺癌（PDAC）的治疗主要包括常规细胞毒性药物。KRAS癌基因的突变激活是维持PDAC生长所需的起始步骤，KRAS突变结合INK4A缺失可触发转移性PDAC的快速发作。与CDK4/6抑制剂联合治疗有望成为一种新策略。KRAS突变的PDAC细胞试图通过上调几个关键的致癌途径来克服CDK4/6抑制的后果。在类器官模型中，CDK4/6和ERK的合理组合可有效阻断KRAS突变体PDAC的代偿激活。该结果为启动评估ERK抑制剂乌利西替尼与帕博西尼联合使用的I期试验以及KRAS突变型PDAC治疗的I期围手术期分析提供了依据。基因修饰的PDAC类器官在PDAC治疗和药物测试中显示出有利的结果。

（4）胃类器官

胃损伤时胃溃疡边缘出现表达Spasmolytic polypeptide/TFF2的化生（SPEM），它代表了严重胃损伤后伤口愈合的主要修复谱系。细胞表面蛋白CD44变异亚型9（CD44v9）在修复过程中在SPEM腺体内表达。应用基因编辑胃类器官原位移植模型，深入探讨CD44在胃上皮再生中的作用。研究人员成功地将表达CD44v9的胃类器官移植到CD44缺陷小鼠的胃上皮中，结果表明CD44v9在增殖细胞中表达，并进一步鉴定类器官细胞在体内的再生和分化情况。与来自老年患者的类胃器官相比，来自年轻患者的类胃器官具有更高的再生能力。因此，CD44是正常胃上皮修复所必需的，其在胃再生中的确切作用有待进一步研究，而转基因胃类器官有望成为进一步研究的有力工具。

（5）肠类器官

肠黏膜损伤在日常实践中很常见，尤其是炎症性肠病（IBD），其治疗困难，复发率高。因此，目前IBD的治疗目标是临床缓解和粘膜愈合以防止复发。基因修饰的肠类器官已被开发用于促进粘膜愈合和再生。与iPSC-MSC共培养的类器官通过TSG-6刺激结肠炎小鼠结肠上皮细胞增殖，促进粘膜愈合，而TSG-6敲除可消除这一作用。进一步用表达CD44的慢病毒转染类器官表明，TSG-6诱导的隐窝上皮细胞增殖依赖于CD44和HA之间的相互作用。这种治疗效果在SLFN11修饰的结肠类器官中是相似的。体外模型显示慢性炎症诱导类器官发生不可逆变化。

另外两项研究使用了另一种肠道类器官模型来评估LINGO3和CD44的治疗潜力。从LINGO3或CD44 KO小鼠的肠道中生长的类器官表现出生长速度减慢和不同结构的明显失调。影像学和组织学分析表明，肠黏膜再生依赖于特定基因的表达。一项研究也评估了表达CircHIPK3的类器官肠上皮的修复能力。结果说明，这些类器官显示出明显更高的细胞增殖和肠粘膜生长，而CircHIPK3沉默则产生相反的结果。因此，慢性和未愈合损伤和肠粘膜破坏的更新可能与CircHIPK3组织水平的显著降低有关。

此外，一项临床和转化试验使用转基因类器官作为体外模型来研究G970R-CFTR基因突变的分子缺陷。在体外，评估患者来源的类器官和RNA分析可以用作表征突变的替代方法。分析表明，G970R-CFTR产生了3个新的剪接变异体，其中c.2908G>C突变导致了隐性剪接缺陷。在另一系列临床研究中，将结直肠癌（CRC）致病基因MHSH2应用于敲除SPINK5的类器官，研究Lynch综合征（LS）结直肠腺瘤和肿瘤的免疫预防策略。证明了萘普生激活不同类型的常驻免疫细胞，改变肠隐窝上皮分化和干细胞调节的表达模式。在最近的一项联合PD-1、BRAF和MEK抑制BRAFV600E CRC的II期试验中，使用表达BRAFV600E的大肠腺瘤性息肉病、SMAD4和TP53敲除的C57BL/6结肠类器官建立了BRAFV600E型CRC小鼠肿瘤模型。BRAF/MEK抑制剂治疗肿瘤中CD3+CD8+T细胞的百分比显著增加，表明单独抑制BRAF通路可导致T细胞浸润增加。

图7 基因编辑类器官在肠上皮再生中的优势结果

（6）胸腺类器官

胸腺是产生多种免疫细胞的中枢淋巴器官，具有识别大量抗原和监测恶性肿瘤的能力。随着损伤和年龄相关的退化，胸腺结构逐渐丧失和紊乱，导致质量下降和对免疫力产生负面影响。胸腺的自我再生能力并不足以重建完整的胸腺功能。因此，组织工程领域在胸腺再生方面做了相当大的努力。研究发现基于OCT4修饰的3D胶原I型支架的胸腺类器官显示出胸腺上皮细胞（TEC）的扩增能力，并维持胸腺功能重要分子Foxn1、Dll4、Dll1和AIRE的表达。在体内实验中，胸腺类器官在裸鼠胸腺皮下移植后血管化。尽管OCT4 TEC胸腺类器官的体内持久性和快速降解有限，但它支持将基因修饰与3D仿生支架的使用相结合的新方法。

三、挑战和未来方向

近十年来，基因编辑类器官的研究取得了显著进展（图8），但这些研究仍处于临床前阶段。目前仍有大量的缺陷阻碍了广泛的临床应用（图9）。

图8 基因编辑类器官应用的重大发现和进展时间表

图9 基因编辑类器官的未来与挑战

1、提高基因修饰的安全性

在基因编辑类器官研究中，类器官移植已成为器官再生治疗的一种有效方法。因此，生产无副作用的治疗性基因产品是再生医学中要求最低的治疗方法。免疫相关排斥反应是病毒基因转移的主要缺陷之一。此外，病毒载体存在病毒传播到其他器官的风险，病毒产生的成本较高。而且病毒载体的整合也存在致癌风险。非病毒转染方法存在转染效率低和基因瞬间表达两大弱点。然而，非病毒载体是一种安全的将基因传递到细胞中的方法，并且在体内表现出更大的适应性和实用性。因此，需要进一步研究非病毒载体，以优化转染效率和基因表达时间。

2、减少基因编辑类器官的时间和资源成本

基因编辑类器官的时间和资源成本高导致其发展受到很大阻碍，改进基因编辑方法或简化培养系统可以被认为是降低成本的激进方法。首先，考虑通过优化Cas9的活性来改进基因修饰技术。通过safeguard-sgRNA策略提高基因组编辑的安全性和适用性，确定Cas9活性的最佳窗口。通过逆转录酶变异筛选、密码子优化、引物编辑截断优化引物编辑技术，成功提高初始编辑效率，从而缓解AAV病毒载体大小限制的问题。脂质纳米颗粒由于其低免疫原性和应用灵活性，已成为CRISPR介导的基因组编辑的一种有吸引力的非病毒传递平台。

其次，简化培养体系和大规模生产已成为新的挑战。体内合成基质培养类器官大大降低了成本，且类器官仍能保持稳定生长和扩增。在搅拌槽培养系统中，通过调整流体动力学参数培养出了大量球体。将3D培养方法与微纳米设备相结合，也可以培养大量的类器官。在球体培养过程中减少球体培养时间是减少缺氧影响和培养成本的一种方法。在冻融循环后，类器官中ATP/ADP的表达也很稳定。发明更便捷的高通量药物筛选方法可能是未来基因修饰类器官发展的方向。

3D结构的复杂性阻碍了类器官用于大规模药物筛选。确定类器官的全面定量表征和发明用于高通量筛选的自动化3D成像技术可能是大规模生产筛选类器官的未来方向。利用多孔板和自动三维成像技术对器官特异性片段进行靶向识别，这可能通过降低安全风险和加速有效和安全药物的生产，对药物研究和开发做出变革性的贡献。

3、提高类器官应用的安全性

基因编辑类器官移植有望成为器官再生的新途径，它在动物实验中已经显示出潜力。然而，还应考虑与干细胞相关的治疗风险及类器官移植的抗原性。

（1）干细胞治疗的潜在风险

PSC的安全问题是可能发生畸形的风险，而且移植的PSC不受控制的增殖和分化可能导致肿瘤发生。此外，多能干细胞的基因组不稳定性，多能干细胞的遗传变异阻碍了新型多能干细胞疗法的发展，并不能保证未来的临床安全性。为了提高PSC的安全性，必须筛选细胞来源、改变递送方式、探索重编程因子、增加细胞传代等。ASC治疗也存在风险，特别是MSC。骨髓间充质干细胞移植存在不定向分化和抑制抗肿瘤免疫反应，从而促进肿瘤生长或转移。因此，必须优化干细胞分化方案，并在动物模型中持续监测和长期随访确定治疗的有害影响，才能应用临床。

（2）类器官移植的潜在风险

类器官移植的风险来自基因改造技术和类器官移植的免疫原性。插入性诱变会导致安全性问题。在体内iPSC移植过程中观察到排斥反应，如T细胞过滤，而ESC不产生T细胞浸润。自体多能干细胞和衍生移植物目前为无排斥细胞治疗提供了机会，但它们的适应症很少，而且急性病由于时间和金钱的问题不能得到及时治疗。免疫抑制剂已被广泛使用来降低免疫原性，但有一定的副作用。改变类器官培养方法也能降低免疫原性。减少细胞因子和动物源性血清的培养会降低免疫原性。如使用自体血清可以改变细胞功能并促进球体形成；此外，基因编辑类器官本身也有可能分泌有助于降低外源性免疫原性的细胞因子。

4、改善类器官仿生学

基因编辑类器官已成为重建复杂3D组织和体外疾病模型的新领域。然而，在他们的仿生学中仍有许多问题需要解决。

（1）形成血管

缺乏功能性血管系统严重阻碍了类器官在再生医学中的应用。血管化消除了对类器官大小和复杂性的物质运输限制，使它们能够更充分地发育和更好地发挥功能。此外，血管分泌因子在一定程度上调节细胞的增殖和分化。因此，提出了各种解决方案来解决与血管化有关的问题。内皮细胞与类器官的共培养是解决类器官血管化的一种解决方案。诱导多能干细胞分化为血管内皮细胞，随后在三维环境中继续培养，也会产生一些血管形成效应。而且，在培养体系中加入生长因子诱导和维持血管，或在培养体系中加入内源性因子促进血管样结构的分化，是解决这一问题的另一种途径。利用3D打印技术在类器官中打印血管网络，实现了大量血管化组织在长时间灌注过程中的功能和成熟。该方法构建的心脏类器官组织功能与体内组织存在较大差异，需要进一步优化。也可在微流控芯片上培养类器官。微流体模拟了血流的机械微环境，流动培养的血管化类器官更接近于实际器官。

（2）系统化

基因编辑类器官作为疾病模型的有效性已在各种体外实验和临床前研究中得到证实。然而，人体组织和微环境的复杂性类器官无法重现。而且，传统的单一类器官无法模拟人体多系统相互作用发生的疾病。因此，构建多系统协同类器官成为解决这一问题的一个新的研究方向。类器官与微流控器官芯片技术相结合，有助于创造更接近体内生理特征的组织微环境，为深入研究类器官提供了新的途径。研究人员开发了一种用于生理和病理条件的微流控多器官系统来复制与人类相关的肝-胰岛轴。其中，肝脏和胰岛类器官在循环灌注系统中共培养1个月，然后建立2型糖尿病疾病模型。系统化类器官的开发对于推进转基因类器官技术具有重要意义。

（3）统一性

由于具有挑战性的培养条件和环境，基因编辑类器官的成功生产很难实现。细胞外基质替代品、胎牛血清和培养基可能导致类器官之间的大量差异。而且，缺乏能够在基因编辑类器官培养过程中能够实时监测各种指标的光学和电化学方法。标准化的生产过程是一个可能的解决方案。一种新型的自动化类器官平台被开发用于高通量生成均匀的类器官前体。利用液滴模板技术为超软支架提供均匀可控的形状。模板液滴的体积决定了类器官的大小。细胞组成在单个基质胶液滴内保持统计学一致。因此，衍生的类器官具有类器官间的同质性。此外，天然和合成聚合物基水凝胶已被证明具有模拟天然ECM的能力，基于水凝胶的类器官与人体器官更相似，可重复性更强，适合大规模药物筛选和再生医学应用。

5、基因编辑类器官潜在的伦理风险

对基因编辑类器官的研究长期以来一直是伦理讨论的焦点。只有在这些伦理问题得到解决后，基因编辑类器官才能应用于临床实践。

（1）嵌合体

类器官技术，包括基因编辑类器官技术，已经成为治疗复杂疾病的一种生物医学工具。然而，嵌合体引发的伦理问题也很严重。这些问题大致可以分为三种类型。首先，发展人类意识是嵌合体最重要的伦理问题之一。由于体外的脑类器官更为复杂，非人类动物的脑类器官移植可能会发展出类似于人类感知的能力或产生自我意识。此外，人类的尊严可能会被获得类人意识的动物所侵犯。而且，捐赠者可能不赞成使用基于其组织的类器官制造嵌合体。随着类器官移植技术的发展，存在一定的“类人外观”风险。

（2）生殖编辑

伦理问题是生殖细胞编辑面临的一个共同挑战。由于使用ESC培养类器官技术在伦理上存在争议，因此经常需要使用ASC或iPSC来创建类器官。大多数国家目前支持，胚胎只有在发育后期才具有绝对的伦理地位，因为早期胚胎没有知觉，但早期胚胎也具有一定的伦理地位。这个观点允许在严格的条件下对胚胎和胎儿组织进行研究。类器官生物库捐赠者的“同意或不匿名”是另一个与伦理相关的研究领域。例如，类器官可以揭示特定个体的个性化信息，包括病史。一些潜在的危害可能与信息和隐私有关。另一方面，类器官与供体具有遗传和功能联系也需要考虑。基因编辑类器官结合了基因组编辑工具和类器官，使伦理考虑进一步复杂化。生殖系统基因组编辑的临床应用可能比一般的基因组编辑更具伦理争议。与基因组基因编辑相关的费用将导致治疗只惠及富有的患者，这样的研究可能更适合于非治疗性修饰。

（3）脱靶效应

限制基因编辑技术在体内应用的最严重问题是脱靶效应。特别是CRISPR-Cas9技术，它的脱靶效应可能导致致命突变，导致基因功能丧失，最终导致细胞癌变。脱靶效应分为两类。第一种类型是由于目标位点的序列同源性而发生的，另一种类型发生在目标位点以外的基因组中。脱靶事件发生的程度与目标基因组的大小和复杂程度有关。已经多次尝试使用各种方法来减少脱靶活动。通过使用sgRNA/Cas9编辑机制改变CRISPR传递方法，可以显著降低脱靶效应。此外，还开发了一种新的碱基编辑器。与HDR相比，该技术可以改变基因组中特定的核苷酸而不引入双链断裂，这是脱靶效应的主要原因。CRISPR-Cas9技术还可以通过抗CRISPR蛋白抑制CRISPR-Cas的免疫功能，从而减少脱靶修饰。围绕基因组编辑设计临床前试验研究和伦理问题的指导方针仍有待建立。具体的伦理挑战需要考虑安全性问题、临床试验的设置以及研究和治疗中招募患者的标准。此外，需要关注何时在基因治疗中实施新概念的决策标准，以及哪些方面的长期后果未知。

四、总结

基因编辑类器官技术在组织再生和工程领域显示出巨大的潜力。目前的制备方法主要包括普通基因转染和类器官制备。未来研究更多的基因转染方法，进一步提高生物安全性和效率。这些方法有望在不久的将来用于临床前研究和人类临床实践。

参考文献

Zhang Q, He J, Zhu D, Chen Y, Fu M, Lu S, Qiu Y, Zhou G, Yang G, Jiang Z. Genetically modified organoids for tissue engineering and regenerative medicine. Adv Colloid Interface Sci. 2024 Nov 13;335:103337. doi: 10.1016/j.cis.2024.103337. Epub ahead of print. PMID: 39547125.